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Elisa试剂盒的温育是如何进行的
发布时间:2022-11-11   点击次数:89次

Elisa试剂盒的操作因固相载体的形成不同而有所差异,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。国内医学检验一般均用板式点。

Elisa试剂盒的操作步骤:

 方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

 1. 包被:用(yong)0.05M PH9.牰碳酸(suan)盐包被缓(huan)冲液(ye)将抗体稀释至蛋(dan)白质(zhi)含量为1~10μg/ml。在每(mei)个聚苯(ben)乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日(ri),弃去孔内溶液(ye),用(yong)洗涤缓(huan)冲液(ye)洗3次,每(mei)次3分钟。(简称洗涤,下同)。

 2. 加样(yang)(yang):加一定(ding)稀(xi)释(shi)的待检(jian)样(yang)(yang)品0.1ml于上述已包被之反应孔(kong)(kong)中(zhong),置37℃孵育(yu)1小时(shi)。然后洗涤。(同时(shi)做空白孔(kong)(kong),阴性(xing)对照孔(kong)(kong)及阳性(xing)对照孔(kong)(kong))。

 3. 加酶标(biao)抗(kang)体(ti):于各反应(ying)孔(kong)中,加入新鲜稀释的酶标(biao)抗(kang)体(ti)(经滴定后的稀释度(du))0.1ml。37℃孵(fu)育0.5~1小时,洗(xi)涤。

 4. 加底物液显色:于各反应孔中(zhong)加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。

 5. 终止反(fan)应(ying):于各反(fan)应(ying)孔中加入2M硫酸(suan)0.05ml。

 6. 结(jie)果判(pan)定:可(ke)于白色背景上,直接用(yong)肉眼(yan)观察结(jie)果:小鼠ELISA试剂盒反(fan)应孔内颜(yan)色越深,阳性程度越强,阴性反(fan)应为无色或较(jiao)浅,依据所呈颜(yan)色的深浅,以“+"、“-"号(hao)表示。也可(ke)测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若(ruo)以ABTS显色,则410nm)处(chu),以空白对照孔调零后(hou)测各孔O·D值,若(ruo)大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

ELISA试剂盒

方法二:用于检(jian)测未知(zhi)抗体(ti)的间(jian)接(jie)法:

用包被(bei)缓冲液将已知(zhi)(zhi)抗原稀释至1~10μg/ml,每孔(kong)加(jia)(jia)0.1ml,4℃过夜。次日(ri)洗涤3次。加(jia)(jia)一定稀释的(de)待检(jian)样品(未(wei)知(zhi)(zhi)抗体(ti))0.1ml于上述(shu)已包被(bei)之反应孔(kong)中,置37℃孵(fu)(fu)育1小时,洗涤。(同时做(zuo)空白(bai)、阴性及阳性孔(kong)对(dui)照)于反应孔(kong)中,加(jia)(jia)入(ru)新(xin)鲜稀释的(de)酶标二抗体(ti)(抗抗体(ti))0.1ml,37℃孵(fu)(fu)育30-60分钟,洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。其余步骤(zhou)同“双抗体(ti)夹心法"的(de)4、5、6。

其中还(hai)有一个步骤特别需要注意(yi)那就是洗涤:

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中,洗涤是非常主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。

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